Diluyentes Vs. diferenciadores: trucos de la Intercambio por anticuerpos diluyentes

La carga, la hidrofobicidad y otras propiedades fisiológicas/químicas pueden afectar las combinaciones de anticuerpo y diluyente. La unión de antígenos a anticuerpos depende del pH y está altamente controlada por interacciones iónicas.

Los diluyentes con un pH relativamente neutro (pH de 7,0 a 7,4) suelen ser tampones ideales y un gran punto de partida para la optimización; “El punto isoeléctrico, o pI (el pH en el que la carga eléctrica neta de una molécula es cero), para las inmunoglobulinas puede oscilar entre 5.8 y 8.5 para un anticuerpo determinado.”1

Si el pH del diluyente está demasiado cerca del pI del anticuerpo, la solubilidad puede debilitarse, dando como resultado efectos negativos en la tinción y el fondo. Las cadenas laterales de aminoácidos en anticuerpos y antígenos también se ven afectadas por el pH, por ejemplo, a pH 6,0, los aminoácidos de histidina están en su mayoría cargados positivamente y atraídos por las cargas negativas del antígeno, pero a un pH de 7.9, los aminoácidos de histidina están en su mayoría sin carga y son repelidos por las cargas negativas del antígeno.

Por lo tanto, se debe elegir un diluyente de anticuerpos que sea compatible con las fuerzas de atracción predominantes para el anticuerpo y el antígeno en particular. Además, los aditivos diluyentes comunes, como las sales y las azidas, utilizados para “reducir las interacciones no específicas entre moléculas cargadas”, pueden afectar la fuerza iónica y alterar la interacción de los anticuerpos.

Una fuerza iónica excesiva puede provocar una disminución de la reactividad de la unión antígeno-anticuerpo. A continuación se presentan algunas cosas importantes a considerar antes de diluir el anticuerpo primario:

• No asuma que todos los diluyentes de anticuerpos son iguales.

• Pruebe el anticuerpo concentrado con diferentes diluyentes (varios pH y composición) si el fabricante no recomienda uno. fabricante de anticuerpos.

• No altere significativamente el pH del tampón diluyente al optimizar.

• Suba y baje el pH en 0,5 unidades de pH si se observa una señal baja o un fondo alto.

• No utilice diluyentes que contengan suero si no es necesario; el suero puede unirse al anticuerpo primario causando una disminución de la sensibilidad o incluso resultados falsos positivos si se une al anticuerpo secundario.

• Tenga cuidado si no hay disponible una opción sin suero; tal vez intente un bloque de proteína endógena separado del diluyente.

• No cambie con frecuencia ni rápidamente la temperatura del diluyente/solución de trabajo, ya que la refrigeración y el calentamiento pueden cambiar la temperatura. pH de tampones sensibles a la temperatura (especialmente tampones basados en Tris).

• Permita que la solución de diluyente/anticuerpo de trabajo alcance la temperatura ambiente antes de usarla. Las soluciones deben prepararse en el temperatura en la que se van a utilizar.

Biocare Medical ofrece una línea completa de diluyentes de anticuerpos que están especialmente formulados para mejorar los títulos de anticuerpos y son extremadamente estables para el almacenamiento de anticuerpos a largo plazo. En la mayoría de los casos, cuando se compara con otros diluyentes basados en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y Tris, los títulos de anticuerpos pueden mejorar de 2 a 4 veces.

Mayores diluciones de anticuerpos primarios pueden proporcionar ahorros de costos, mayor especificidad y reducir la tinción de fondo no específica. Los diluyentes de Biocare están listos para usar y no contienen proteasa ni IgG. Para mayor comodidad, todos los anticuerpos primarios de Biocare Medical se prueban con todos los diluyentes de Biocare y en la hoja de datos se recomienda el diluyente que produce resultados óptimos.

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